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石斛堿主要來源于中藥材鐵皮石斛等的莖部,是一種吡咯里西啶衍生物。它是含氮的有機化合物,化學式為C16H25NO2,分子量為263.27,易溶于乙醚、氯仿,難溶于乙醇、水。它具有多種藥理作用,比如止痛和解熱,降低心律和血壓,促進消化和調(diào)節(jié)免疫力等。它的生物活性與木防己毒素相似,根據(jù)分子結(jié)構(gòu)來判斷屬于倍半萜類生物堿,可應用于藥物代謝研究等領(lǐng)域。
檢測樣品中的石斛堿含量,實驗室常用的方法有高效液相色譜(HPLC),氣相色譜(GC),液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)等。
以HPLC為例
1.樣品處理
獲取中藥材鐵皮石斛或其他種類的植物樣品,進行粉碎過篩,精密稱量5g,置于25ml的容量瓶中,加入20ml的甲醇,超聲提取30min。取出,在室溫下冷卻,用甲醇定容。用0.22um的微孔濾膜過濾,待測。
2.色譜條件
C18的色譜柱,長250mm,內(nèi)徑4.6um,粒徑5um。柱溫30℃。甲醇和磷酸二氫鉀(KH2PO4)(65:35)為流動相,等度洗脫,流速1ml/min。紫外檢測器,波長260nm,進樣量10-20uL。根據(jù)實際環(huán)境條件和設(shè)備參數(shù),進行適當?shù)恼{(diào)整。比如有用水+乙腈為流動相,梯度洗脫,盡可能的將樣品中的石斛堿洗脫出來,并在檢測器中顯示完整有效的色譜峰。
3.標準曲線
準確稱取石斛堿的標準品,放在10ml的容量瓶中,用甲醇進行溶解,梯度的稀釋成5-7個濃度點作為標準工作溶液,記錄濃度值。在有效的色譜條件下,注射到HPLC中,或手動或自動,在軟件中記錄色譜峰的保留時間和位置。觀察色譜圖的出峰情況,將幾個色譜峰面積進行積分處理,對應到每個峰的標準溶液濃度,在表格中可以繪制出標準曲線??梢钥吹较嚓P(guān)系數(shù)r2一般是大于0.999,確保測定數(shù)據(jù)在良好的線性范圍內(nèi)。
4.樣品測定和計算
將樣品注入HPLC中,和標準品相同的色譜條件下,測定并記錄色譜峰和數(shù)據(jù)。對目標色譜峰進行識別,并對峰面積進行積分,代入到回歸方程,計算出樣品的石斛堿含量??疾炀芏龋瑯悠贩€(wěn)定性,回收率,方法重復性。