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dATP是脫氧腺苷三磷酸的簡寫,它的化學結構和ATP是相似的,只是少了一個五碳糖2號碳上的-OH,取而代之的是一個單獨的氫原子。從結構上來看,dATP是由一個脫氧核糖,磷酸和腺嘌呤組成的。在NDA復制的過程中,DNA聚合酶利用dATP作為原料,通過磷酸二酯鍵連接起來,形成DNA鏈。
檢測樣品中dATP含量的方法,包括高效液相色譜(HPLC),毛細管電泳(CE),液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS),酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法。以HPLC為例,簡單的介紹一下檢測流程。
1.樣品處理
將含有dATP的樣品進行溶解,稀釋,過濾,有機溶劑的萃取,衍生化處理,待測。
2.色譜條件
如C18色譜柱(250*4.6mm,5um),柱溫30-40℃;甲醇和0.1%磷酸溶液(pH2.5)梯度洗脫,流速1ml/min。紫外檢測器,波長260nm,進樣量10uL。
3.標準曲線
將標準品進行溶解和稀釋,用流動相有機溶劑梯度稀釋6個濃度并記錄。通過HPLC依次測出對應的色譜峰,記錄保留時間和峰面積。對峰面積進行積分,對應到它的標準溶液濃度,繪制標準曲線,得到回歸方程,相關系數(shù)r2>0.999。
4.樣品測定和計算
對樣品也進HPLC測定它的色譜峰,在保留時間的地方找到目標峰,記錄色譜峰面積。對面積進行積分,代入到回歸方程,可以計算出樣品中的dATP含量。同時,也需要考慮到回收率,線性范圍,檢出限,重復性等。